Tec family チロシンキナーゼであるTxkを介する1型ヘルパーT（Th1）細胞特異的な細胞内シグナル伝達機構の解析

2015-03-25

2015-03-25

Txkは、Tecファミリーに属する非受容体型チロシンキナーゼであり、1型のヘルパーT（Th1）細胞とナイーブへルパーT（Th0）細胞に特異的に発現し、2型ヘルパーT（Th2）細胞には発現しない。Txkは、T細胞の活性化に伴って核内に移行し、インターフェロン(IFN)-γプロモーター領域のTxk応答配列 (Txk responsive element: Txk-RE) DNAに結合して、その転写活性化を特異的に調節することが報告されている。しかしながら、Txkを介するIFN-γ特異的な発現調節機構については、十分に解明されていない。そこで、本研究ではTxkを介するTh1細胞特異的な細胞内シグナル伝達機構の解明を目的に検討を行った。 第2章では、IFN-γプロモーター領域のTxk-RE DNAに結合するタンパク質の同定を試みた。PHA-Lで刺激したJurkat細胞の核タンパク質から、ビオチン標識Txk-RE二本鎖DNA（-53/-39）に結合するタンパク質を回収し、アミノ酸解析を行ったところ、Txkと結合する分子として、poly(ADPribose) polymerase 1 (PARP-1) 及びelongation factor 1alpha (EF-1α)を同定した。 第3章では、遺伝子組換えタンパク質を用いたインビトロ試験において、Txkが自己リン酸化及びEF-1α及びPARP-1のリン酸化を誘導し、複合体を形成すること、また、3分子複合体がTxk-RE DNAに結合することを証明した。特に、3分子複合体の形成には、DNA結合ドメインを含むPARP-1のN末端領域が重要であることを示した。また、キナーゼ活性を欠失するTxk変異体タンパク質を用いて同様の検討を行ったところ、複合体の形成は認められなかったことから、3分子複合体の形成にはTxkのキナーゼ活性が重要であると考えられた。一方で、PARP-1によりTxkがポリADPリボシル化されることを確認した。また、ヒト末梢血リンパ球の活性化に伴うIFN-γ産生がPARP-1酵素阻害剤により顕著に抑制されること、一方で、Interleukin (IL)-4産生にはほとんど影響が認められないことを示した。これらの結果から、PARP-1は、Txkを介するTh1細胞特異的シグナル伝達を促進的に調節していると考えられた。さらに、共焦点レーザー顕微鏡を用いたCOS7細胞におけるマルチカラー解析において、Txkの活性化に依存したTxk、EF-1α及びPARP-1の核における共局在が観察された。以上の結果から、Txkは活性化に伴ってEF-1αおよびPARP-1と複合体を形成し、IFN-γプロモーター領域のTxk-REに結合することによって、IFN-γ特異的に転写活性化を誘導すると考えられた。 一方、第3章の検討でJurkat細胞におけるTxk複合体のTxk RE DNAへの結合が、T細胞受容体（TCR）刺激の1時間後以降、減少することが見出された。核内に発現する何らかの分子が、Txk複合体を介したIFN-γ転写活性化を抑制的に調節している可能性が示唆される。細胞内におけるタンパク質のチロシンリン酸化は、キナーゼとフォスファターゼ（protein tyrosine phosphatase：PTP）によって調節されており、内因性のPTPによりTxkの脱リン酸化が誘導されている可能性が示唆された。T細胞に発現するPTPは、60種類以上確認されている。核内で発現するPTPは限られるが、非受容体型PTPのひとつであるT-cell PTP（TCPTP）は、核移行シグナル配列を有し、核内で働くPTPのひとつと考えられている。　そこで第4章では、TCPTPがTxkの脱リン酸化を誘導するか検討した。TCPTPには、核型（TC45）と細胞質型（TC48）の2つのスプライスバリアントが存在する。TC45をCOS7細胞に発現させたところ、TC45は核と細胞質の両方に認められた。一方、TC48を発現させたCOS7細胞では、TC48は主に細胞質において認められた。また、TC45を発現させたCOS7細胞では、核におけるTxkの脱リン酸化が観察された。一方で、TC48を発現させたCOS7細胞では、Txkの脱リン酸化は認められず、むしろTxkのリン酸化は促進、持続化した。これらの結果から、細胞質ではなく、核に発現するTCPTP（TC45）がTxkの脱リン酸化に関与していると考えられた。　さらに第5章では、Jurkat細胞における内因性のTCPTPがTxkのリン酸化にどのような影響を及ぼすか検討した。Jurkat細胞における内因性のTCPTPを特異的なsiRNAを用いてノックダウンしたところ、PHA-L/PMA刺激後60分のTxkのリン酸化が顕著に亢進した。以上の結果から、核に存在するTCPTPは、Txkのリン酸化の調節に重要な役割を担っていると考えられた。

博士（学術）

京都工芸繊維大学

14303甲第739号

http://hdl.handle.net/10212/2257

ja

ETD

Thesis or Dissertation

Thesis