Cell biological and genetical studies on DNA replication enzyme and protein modification enzyme in Drosophila

ショウジョウバエ DNA 複製酵素及びタンパク質修飾酵素の細胞生物学・遺伝学的解析

2014-03-25

2014-03-25

DNAポリメラーゼα,δ,そしてε（polα, polδ,polε）はゲノムのDNA合成を行う酵素である。polαがRNAプライマーとそれに引き続く20〜30塩基のDNAを合成し、その後、polαと置き換わったpolδ,polεが、それぞれ、ラギング鎖、リーディング鎖の合成を行うことがわかっている。先行研究によりpolαと相互作用する因子の１つとして、ヒストンH4の20番目のリジン残基（H4-K20）をモノメチル化する酵素であるPr-Set7が同定された。第1章において、私はDNA複製とヒストンH4-K20メチル化との関係及び、polαとPr-Set7の相互作用について注目をした。翅原基特異的にショウジョウバエpolαの触媒サブユニットであるpolα180kDaサブユニット（dpolαp180）をノックダウンすると成虫翅の萎縮（atrophied wing表現型）が見られdpolαp180とdPr-Set7のダブルノックダウン系統では、atrophied wing表現型の増強が見られた。また、dpolαp180ノックダウン系統の翅原基でのDNA合成をモニターするためBrdU incorporation assayを行なった結果、BrdU ポジティブな細胞数に減少がみられ、dpolαp180とdPr-Set7のダブルノックダウン系統では、BrdU ポジティブな細胞数は、さらに減少した。これらのことより、個体レベルでも両者の機能的関連が示唆され、dPr-Set7がdpolαとの相互作用を介してDNA複製の制御に関与することが示唆された。また、dpolαp180をノックダウンした翅原基における抗H4-K20モノメチル化抗体を用いた免疫染色法の結果、H4-K20モノメチル化のシグナルが減少するこを明らかにした。このことより、Pr-Set7のメチル化活性制御にdpolαが重要な働きを担っている可能性が示された。　2章では、ショウジョウバエpolεの58 kDサブユニット（dpolεp58）の機能解析を行った。polεはヘテロ4量体タンパク質であることが報告されているが、ショウジョウバエでは、現在のところ、触媒サブユニットである255 kD (dpolεp255)サブユニットと、2番目サブユニットのdpolεp58サブユニットが同定されている。dpolεp58変異系統は、蛹で致死となり、3齢幼虫の成虫原基や唾腺が野生型と比較して小型化していた。これらのことからdpolεp58が組織の成長、細胞増殖および生存に必須であると示唆された。dpolεp58変異系統3齢幼虫の複眼原基では、形態形成溝の後極側におけるBrdUの取り込みが減少し、通常は増殖が停止し、分化している後極側の細胞でM期のシグナルが増加していた。S期の遅延が引き起こされたため、後極側の細胞におけるM期のシグナルが増加したと考えられる。これらの結果より、dpolεp58がS期の進行に関与している事が明らかとなった。また、唾腺の核が野生型と比較して小型化している事が観察され、dpolεp58のendoreplicationへの関与も示唆された。さらに、変異系統を用いて他の複製関連因子の抗体でウエスタン免疫ブロットを行った結果、複製開始因子であるdOrc2レベルの顕著な減少が見られた。このことからdpolεp58とdOrc2が細胞内で相互作用する可能性が示めされ、これらのことよりpolεが複製開始に関与することが示唆された。 第3章では、ショウジョウバエの発生において、私は、ショウジョウバエトランスグルタミナーゼ B（dTG-B）の働きを理解することを目的にdTG-B過剰発現系統を用いてその表現型の解析を行った。トランスグルタミナーゼ（TG）は、タンパク質間の架橋反応を触媒するタンパク質間翻訳後酵素で、様々な生物学的プロセスに関わっている。ショウジョウバエトランスグルタミナーゼの遺伝子は1種類で、A型とB型の2種類の転写産物が作られる。dTG-B過剰発現系統では、rough eye表現型と翅脈の過形成が観察された。これらの表現型は、先行研究により報告されているトランスグルタミナーゼA（dTG-A）の過剰発現系統において観察された表現型と同様であり、これらの結果からdTG-Aだけでなく、dTG-Bも複眼の形成と翅脈の形成において、その制御に関わっていることが示唆された。

博士（学術）

京都工芸繊維大学

14303甲第687号

http://hdl.handle.net/10212/2155

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Thesis or Dissertation

Thesis